Research

У пошуках протиотрути від CRISPR: чи можна звертати зміни в генах?

Коли вчені, які стоять за Манхеттенським проектом,дізналися про руйнування Хіросіми і Нагасакі, захоплений ентузіазм змінився похмурим жалем. Те, що починалося як революція в галузі фізики, мутували в зброю масового ураження - від якого неможливо було захиститися. З точки зору біології, у CRISPR є руйнівна сила подібних масштабів. І вчені не хочуть, щоб історія знову повторилася.

CRISPR: ядерна зброя в світі біології

Всього через п'ять років після відкриття CRISPRАгентство перспективних оборонних досліджень DARPA ініціювало програму «Безпечні гени»: співпраця семи провідних світових експертів в області редагування генів, спрямоване на пошук різноманітних протиотрут від CRISPR і поліпшення можливостей редагування генів в просторі і часі.

Сенс не в тому, щоб підживлювати громадськийстрах перед потужним інструментом; скоріше, потрібно завчасно побачити потенційні небезпеки і знайти профілактичні заходи або контрзаходи. Якщо CRISPR - це біологічний ящик Пандори, він вже відкритий: в клініках почалися випробування CRISPR на людях; в лабораторії технологія перетворюється в генні драйви, здатні знищити цілі види. Мета програми Safe Genes - знайти спосіб, або багато способів знову зачинити цей ящик.

Минулого тижня пошуки антидоту CRISPR сталище активніше. Команда на чолі з доктором Амітом Чоудхарі з Інституту Брода при Массачусетському технологічному інституті, членом Safe Genes, розробила платформу «скринінгу» для швидкого просіювання більш 10 000 дрібних хімічних речовин, які знижують активність ножиць Cas9.

Команда допрацювала структуру декількохбагатообіцяючих кандидатів, щоб ще більше підвищити їх здатності протидіяти CRISPR, і створила дві молекули-антидоту, які перешкоджають зв'язуванню Cas9 з мішенню ДНК і її розрізання. Під час випробувань на клітинах людини в чашках Петрі молекули пропливали через клітинні мембрани і надійно знищували активність CRISPR протягом декількох хвилин.

Ці препарати - найперші кандидати - і вониможуть бути ще більш токсична, ніж навіть CRISPR, нехай рознос всередині організму. Вченим доведеться перевірити їх на тварин, щоб оцінити ефективність і безпеку.

Але невеликі препарати, які протидіютьCRISPR, навіть найперші, доводять, що титану CRISPR можна зупинити. З платформою скринінгу з'являється шанс знайти ще більш потужні кнопки «відміни»: хімічні речовини, які одного дня можуть перетворитися в уколи або пігулки, які блокують небажану активність по редагуванню генів, в медичній сфері або навіть в біологічну зброю.

«Ці результати закладають основу для точного хімічного контролю активності CRISPR / Cas9, прокладаючи шлях до безпечного використання таких технологій», говорить Чоудхарі.

Що вже є на поточний момент?

Чоудхарі не єдиний з команди Safe Genes, хто шукає молекули анти-CRISPR.

У 2013 році інший член проекту, доктор ДжозефБонди-Деном з Каліфорнійського університету в Сан-Франциско допоміг знайти перші препарати анти-CRISPR: великі, незграбні білки, які блокують ножиці Cas9, не дозволяючи їм дізнатися молекули ДНК або зв'язатися з ними. Його геніальна ідея полягала в тому, щоб повернутися до природних коренів CRISPR як системи бактеріальної імунного захисту від вірусів.

За своєю суттю, CRISPR дозволяє бактеріям зберігати«Фотокартку злочинця» - вірусної ДНК - в своєму власному геномі, так що коли вірус знову атакує, ножиці Cas можуть розірвати вірус на шматочки. Але фаги теж не промахи. У еволюційної гонці вони також виробили гени, що створюють білки анти-CRISPR, щоб протидіяти імунному захисті бактерій.

Звернувшись до біології фагів анти-CRISPR в 2012році, Бонді-Деном виявив кілька нових білків, які широко інгібують активність Cas12a - альтернативу Cas9, яка набирає популярність в якості діагностичного інструменту. Працююча окремо Дженніфер Дудна з Каліфорнійського університету в Берклі, один з перших відкривачів CRISPR і також член проекту, використовувала біоінформатику, щоб вистежити жменьку Cas12a-вбивць, які блокують активність по редагуванню генів в вирощених клітинах людини.

У той час Дудна сказала, що ці результати «прокладають прямий шлях до відкриття ще більшої кількості анти-CRISPR зі світу мікробів».

крихітні вогники

І все ж, білки анти-CRISPR не особливо корисні вимикачі в реальному світі.

З білками складно: вони великі і незграбні, тому не можуть проникати в клітини і вгризатися в механізми CRISPR. Вони чутливі до змін температури і травлення і не особливо довго живуть всередині тіла. Багато з них стають привабливою здобиччю для нашої імунної системи, яка може запустити дратівливі - якщо не небезпечні - алергічні реакції.

Маленькі молекули, як правило, таких проблем немають. Вони швидкі, дешеві і їх ефекти оборотні. Чи не хочете заважати CRISPR? Просто почекайте, поки молекули вимиються. Але ефективні дуже важко знайти.

І ось тут допоможе платформа скринінгу Чоудхарі.

Високопродуктивна система просіює десяткитисяч хімічних речовин, використовуючи два тести, в пошуках обіцяють. Спершу вона моніторить сегменти ДНК, прив'язуючись до ножиць Cas9 за допомогою неонових вогників. ДНК розмічається флуоресцентними «лампочками», які змінюють поляризацію при зв'язуванні з Cas9, подібно до того, як поляризаційні окуляри змінюються на сонячному світлі. Це дозволяє команді швидко відслідковувати, чи порушує молекула зв'язок Cas9 з ДНК.

По-друге, система використовує автоматичнімікроскопи, які шукають флуоресцентні сигнали в клітинах, придбані або втрачені в процесі активності Cas9. В одній з робіт вчені використовували клітини, які зазвичай світяться зеленим, поки Cas9 не вирізане ген. Потенційний препарат анти-CRISPR дозволить клітинам залишатися зеленим навіть в присутності дози CRISPR.

В процесі роботи вчені виявили молекулуBRD0539, яка не дозволяє Cas9 зв'язуватися з цільовою послідовністю ДНК. Дії препарату були абсолютно передбачувані: чим вище доза, тим сильніше він придушував активність CRISPR.

Ці результати вже допомагають знизити побічніефекти CRISPR в терапевтичних умовах. У клітинах доза такого препарату швидко знижувала здатність розрізання Cas9 вдвічі, що, в свою чергу, знижувало ненавмисне вирізання HBB - гена, залученого в серповидноклеточную анемію - в п'ять разів.

Неважко уявити собі майбутнє, в якому виможете випити таблетку з BRD0539 - або більш потужний еквівалент наступного покоління - щоб тимчасово знизити або зупинити дію CRISPR, перш ніж він пуститься в рознос в вашому тілі. Препарат, будучи невеликою молекулою, залишається стабільним у вашій крові і легко проникає у ваші клітини, виступаючи в ролі гальма, коли CRISPR дуже сильний.

Як ви думаєте, чи стане CRISPR ядерною бомбою в світі біології? Поділіться з нами в нашому чаті в Телеграма.