Research

CRISPR став потужнішим, завдяки «вимикача»

При всіх своїх приголомшливих можливостіредагування генів, механічно CRISPR нагадує електроінструмент з поламаним вимикачем. Просто вдумайтеся: весь механізм CRISPR вибудовується в пробірці, а після завершення він завжди активний, включений, працює. Після введення тваринам або людям, CRISPR починає блукати по всьому тілу в пошуках цільового гена, який повинен відредагувати або знищити, поки не втратить силу і не засвоїться організмом.

Послаблення контролю молекулярногоелектроінструменту, очевидно, не буде ідеальним рішенням: він може перестаратися і поламати нецільові гени. І якщо щось піде не так, немає негайного способу вимкнути механізм, перш ніж він завдасть шкоди.

На початку цього місяця команда з Каліфорнійськогоуніверситету в Берклі спробувала приручити звіра CRISPR. Використовуючи техніку кругової перестановки, команда реорганізувала CRISPR в програмований інструмент ProCas9, який тихо ховається в клітинах, поки його не розбудять зовнішні чинники - наприклад, вірусна інфекція.

Цей «додатковий рівень безпеки» обмежує навички редагування CRISPR підмножиною клітин «для точної різки», говорить автор дослідження доктор Девід Севідж.

Більш того, ProCas9 може потенційнореагувати на логічні вхідні дані, такі як «і» або «ні», що означає, що він буде активований тільки при дотриманні певного набору інструкцій - наприклад, «ця клітина ракова» або «ця клітина інфікований» призведе до відповіді «пожертвувати кліткою» , який активує CRISPR і дасть йому вказівку різати гени, необхідні для виживання. Дослідження було опубліковане в престижному журналі Cell.

Взяти під контроль CRISPR

Давайте злегка освіжимо в пам'яті: CRISPR, як інструмент редагування генів, насправді являє молекулярний дует. Перша частина, яка спрямовує РНК, це крихітні криваві гончаки, які шукають цільової ген.

Як тільки ген захоплений, другий компонент - Cas9- активується для виконання розрізання. На відміну від напрямних РНК, які складаються з генетичних букв, Cas9 є білком. Саме з цим компонентом вирішили пограти вчені з Берклі.

«Широка мета нашої роботи - приборкати і для використання людьми і прибрати непотрібні речі, які не відносяться до редагування генома», говорить Севідж.

Що ж можна зробити з білком? Уявіть собі дуже довгий ланцюжок пронумерованих кульок (амінокислот), зім'ятих в складну тривимірну структуру. Розріжте ланцюг і зможете реорганізувати намистини так, щоб їх положення на нитки відрізнялося від вихідного, і скласти їх в вузол або два при повторному з'єднання білкової нитки.

Саме це, по суті, зробила команда. Цей трюк називається «кругової перестановкою» і перетворює вихідний білок так, що у нього з'являється новий початок і кінець - і він складається в іншу форму. Це величезна операція на молекулярному рівні, яка зазвичай руйнує функцію білка.

Автори кажуть, що не були впевнені, що це спрацює з чимось таким складним, як Cas9.

Дивно, але Cas9 виявився майже тестом. Команда спробувала розрізати його в безлічі точок, перш ніж знайти відрізи, які зберігали функцію білка, але в 10% випадків пересобран Cas9 працював майже так само, як і оригінал.

Тут є один розумний момент: при повторному з'єднанні білкових ниток команда прослизнула в молекулярні «ворота» - невеликий линкер - які блокували ріжучу здатність Cas9, якщо сам линкер не було поламано.

Що ж розбивало ланцюга? Набір ферментів, званих протеазами.

Протеазочувствітельний линкер

Уявіть протеази як крихітні ножиці длябілка, які плавають в тілі. Їх ціла сім'я: хороші допомагають нам перетравлювати стейки і боби. Але є і погані. Ракові клітини, наприклад, відкачують свої власні «злі» протеази, які розривають навколишні тканини, сприяючи їх зростанню. Віруси також можуть секретувати вірусні протеази, що часто необхідно для їх проникнення в множинні клітини і тканини. Зика і денге є одними з тих, хто використовує протеази як своєї зброї, а протеази від заражають рослини вірусів допомагають оскверняти картопля та інші культури.

Але протеази не ріжуть по своєму бажанню. Швидше, кожна з них призначена лише для невеликого числа амінокислотних послідовностей - «поштових індексів», які вона розпізнає і розрізає.

Це означає, що команда може поміститипевний поштовий індекс, що відповідає певній протеази - наприклад, з ракових клітин - в реорганізований білок Cas9 як линкера. Таким чином, линкер буде різати тільки в клітинах, які мають цю специфічну протеазу, а значить і включатися буде тільки в цих клітинах. Залежно від направляючої РНК, команда може спроектувати активоване CRISPR, щоб розрізати гени, необхідні для виживання - і тим самим вбивати ракову клітину.

У цьому сенсі нові білки Cas9, що отримали назву ProCas9 ( «pro» через «протеази»), перетворюються в крихітні шпигунські машини, які стають смертельно небезпечними після активації.

Вбивця-альтруїст

Щоб перевірити концепцію, вчені представили інфіковані Зика клітини своєму новому ProCas9, оснащеному напрямними РНК, навченими для пошуку генів, що підтримують життя клітин.

Всього за тиждень нова система CRISPR знищила інфіковані клітини в якості «альтруїстичної захисту». Здорові клітини залишилися живі і незаймані.

Це показало, що система залишалася спокійною в мирний час, таким чином, обмежуючи геномної збиток власникові, каже автори.

В окремих експериментах система ProCas9 працювала так само добре, приносячи в жертву інфіковані вірусом Західного Нілу клітини.

«Хоча це дуже раннє підтвердження концепції,воно демонструє ідею того, що це може бути синтетична імунна система », говорить автор дослідження Бенджамін Оукс. «Ми створили білок, який виявляє приховану загрозу, який можна запрограмувати на що завгодно».

Нова система CRISPR навряд чи завдасть шкоди нашійімунній системі. Ще одним перевагу перебудови білка є те, що його нові кінці краще переносять вантажі, такі як інші модифікуючі ДНК ферменти або індикатори, що світяться в темряві.

Нібито Cas9 обзавівся новою суперсилою, якадозволяє нам відстежувати, де в клітці знаходиться білок, або ж змінювати експресію певних генів - замість того, щоб безпосередньо псувати наш генетичний матеріал.

Команда з Берклі вже передбачила кількаваріантів використання. ProCas9 буде корисний для молекулярного скринінгу або відкриття ліків. Або ж він може обмежити обрізання ДНК певними клітинами «після загальної доставки редактирующего комплексу в цільову тканину або орган», що значно підвищить профіль безпеки інструменту, особливо в клінічних умовах.

Але найцікавіше в усьому цьому те, що ми неприв'язані до механізму CRISPR, яким нас наділила природа. Ці білки можна ретельно оптимізувати і посадити в каркаси, що не зустрічаються в природі, але володіють необхідними властивостями для використання в клітинах людини, дослідження або лікування, каже Севідж.

А які застосування нового інструменту бачите ви? Розкажіть про це в нашому чаті в Телеграма.