CRISPR se díky "přepínači" stal silnějším

Se všemi jeho úžasnými schopnostmieditace genů, mechanicky CRISPR připomíná elektrické nářadí s přerušeným spínačem. Jen si myslím: celý mechanismus CRISPR je vybudován ve zkumavce a po dokončení je vždy aktivní, zapnutý a funkční. Poté, co byl CRISPR představen zvířatům nebo lidem, začíná putovat po celém těle při hledání cílového genu, který musí být upraven nebo zničen, dokud neztratí svou sílu a nebude tělem absorbován.

Oslabení molekulární kontrolyElektrické nářadí samozřejmě není dokonalým řešením: může to přehnat a rozbít necílové geny. A pokud se něco pokazí, neexistuje okamžitý způsob, jak mechanismus vypnout dříve, než způsobí poškození.

Na začátku tohoto měsíce tým z KalifornieUniverzita Berkeley se pokusila zkrotit šelmu CRISPR. Pomocí kruhové permutační techniky tým reorganizoval CRISPR na programovatelný nástroj ProCas9, který se tiše schovává v buňkách, dokud se to neprojeví vnějšími faktory - například virovou infekcí.

Tato „mimořádná úroveň bezpečnosti“ omezuje dovednosti úpravy CRISPR na podmnožinu buněk „pro přesné řezání“, říká autor studie Dr. David Savage.

ProCas9 navíc může potenciálněreagují na logické vstupy, například „a“ nebo „ne“, což znamená, že budou aktivovány pouze v případě, že budete postupovat podle specifického souboru instrukcí - například „tato buňka je rakovinová“ nebo „tato buňka je infikována“ povede k odpovědi „darovat buňku“ , který aktivuje CRISPR a instruuje jej, aby řezal geny nezbytné pro přežití. Studie byla publikována v prestižním časopise Cell.

Převezměte kontrolu nad CRISPR

Pojďme trochu osvěžit: CRISPR, jako nástroj pro editaci genů, je ve skutečnosti molekulárním duetem. První část, směřující RNA, je drobná krvavá psi, kteří hledají cílový gen.

Jakmile je gen zachycen, druhá složka - Cas9- aktivováno pro řezání. Na rozdíl od naváděcích RNA, které se skládají z genetických písmen, je Cas9 protein. Právě s touto složkou se vědci z Berkeley rozhodli hrát.

„Širokým účelem naší práce je zkrotit a použít lidské věci a odstranit zbytečné věci, které nesouvisejí s úpravami genomu,“ říká Savage.

Co lze udělat s proteinem? Představte si velmi dlouhý řetězec číslovaných kuliček (aminokyselin) zmačkaných do komplexní trojrozměrné struktury. Řez řetězec a být schopen reorganizovat korálky tak, aby jejich pozice na niti se liší od původní, a dát je do uzlu nebo dva, když znovu připojte protein vlákno.

To je v podstatě tým. Tento trik se nazývá „kruhová permutace“ a transformuje původní protein tak, že má nový začátek a konec - a vyvíjí se do jiné podoby. Jedná se o obrovskou operaci na molekulární úrovni, která obvykle ničí funkci proteinu.

Autoři říkají, že si nebyli jisti, zda bude fungovat s něčím tak komplexním jako Cas9.

Překvapivě, Cas9 byl téměř test. Tým se pokusil rozřezat ho na několik bodů, než zjistil řezy, které si zachovaly funkci proteinu, ale v 10% případů znovu sestavený Cas9 pracoval téměř stejně jako originál.

Zde je jeden chytrý bod: při opětovném připojení proteinových vláken, tým vklouzl do molekulární „brány“ - malého linkeru, který blokoval schopnost řezu Cas9, pokud samotný linker nebyl zlomen.

Co rozbilo řetězy? Sada enzymů zvaných proteázy.

Linker citlivý na proteázy

Představte si proteázy jako malé nůžkyveverky, které plavou v těle. Jejich celá rodina: dobré nám pomáhají trávit steaky a fazole. Ale jsou špatné. Například rakovinné buňky čerpají vlastní "zlé" proteázy, které roztrhnou okolní tkáně a podporují jejich růst. Viry mohou také vylučovat virové proteázy, které jsou často nezbytné pro jejich pronikání do více buněk a tkání. Zika a dengue patří mezi ty, kteří používají proteázy jako své zbraně, a proteázy z virů infikujících rostliny pomáhají znesvětit brambory a jiné plodiny.

Proteasy však nejsou naříznuty. Každý z nich je určen pouze pro malý počet aminokyselinových sekvencí - „zip kódy“, které rozpoznává a řeže.

To znamená, že tým může dátspecifický zip kód odpovídající specifické proteáze - například z rakovinných buněk - reorganizovanému Cas9 proteinu jako linkeru. Linker bude tedy štěpen pouze v buňkách, které mají tuto specifickou proteázu, a proto budou zahrnuty pouze do těchto buněk. V závislosti na naváděcí RNA může tým navrhnout aktivovaný CRISPR, aby rozdělil geny nezbytné pro přežití - a tak zabil rakovinnou buňku.

V tomto smyslu se nové proteiny Cas9, zvané ProCas9 („pro“ kvůli „proteáze“), stávají malými špionážními stroji, které se po aktivaci stávají smrtícími.

Altruist Killer

Abychom mohli tento koncept otestovat, vědci představili buňky infikované Zika jejich novému ProCas9, vybavenému vodítky RNA, vyškolenými k hledání genů, které podporují život buněk.

Během jednoho týdne nový systém CRISPR zničil infikované buňky jako „altruistickou obranu“. Zdravé buňky zůstaly živé a neporušené.

To ukázalo, že systém zůstal klidný v době míru, což omezuje poškození genomu hostitele, říkají autoři.

V některých experimentech ProCas9 fungoval stejně dobře a obětoval buňky infikované virem West Nile.

„Ačkoli se jedná o velmi brzké potvrzení tohoto konceptu,ukazuje, že by to mohl být syntetický imunitní systém, “říká autor studie Benjamin Oaks. "Vytvořili jsme protein, který detekuje skrytou hrozbu, kterou lze naprogramovat na cokoliv."

Je nepravděpodobné, že by nový systém CRISPR zasahoval do našeho systémuimunitní systém. Další výhodou přeskupení proteinu je, že jeho nové konce nesou zátěž lépe, jako jsou jiné enzymy modifikující DNA nebo indikátory zářící ve tmě.

Jako kdyby Cas9 dostal novou supervelmoci, kteránám umožňuje sledovat, kde je protein v buňce, nebo změnit expresi určitých genů namísto přímého poškození našeho genetického materiálu.

Tým z Berkeley již poskytl několikpřípady použití. ProCas9 bude užitečný pro molekulární screening nebo pro objevování léčiv. Nebo může omezit řezání DNA na určité buňky „po úplném dodání editačního komplexu do cílové tkáně nebo orgánu“, což výrazně zvýší bezpečnostní profil nástroje, zejména v klinických podmínkách.

Ale nejzajímavější na tom všem je, že nejsou vázány na mechanismus CRISPR, který nám příroda obdařila. Tyto proteiny mohou být pečlivě optimalizovány a umístěny do skeletů, které nejsou v přírodě, ale mají nezbytné vlastnosti pro použití v lidských buňkách, výzkumu nebo léčbě, říká Savage.

A co vidíte pro nový nástroj? Řekněte nám o tom v našem chatu. v Telegramu.